Qu’est-ce que la Chromatographie Liquide (CL) ?

Il existe deux types de chromatographie : la chromatographie en phase gazeuse qui sépare les composants volatils d'un échantillon et la chromatographie liquide/liquide qui sépare les molécules neutres de petite taille en solution. Des deux solutions de séparation, la chromatographie en phase liquide (CL) est la méthode la plus souvent appliquée.

Vous souhaitez approfondir ce sujet avec nos experts ? Contactez-nous →

Contactez un expert

Le fonctionnement de la chromatographie liquide

La chromatographie liquide est un type de chromatographie, très répandu de séparation des molécules d’un d'échantillon (soluté). Cet échantillon est dilué dans un solvant que l’on appelle la phase mobile. La séparation a lieu sur la base des interactions moléculaires entre ses propres molécules et la phase stationnaire (substrat).
La chromatographie liquide utilise soit la perméation avec un gel, soit les échanges d'ions. La perméation gel consiste à séparer les molécules selon leur taille et la méthode d’échanges d’ions consiste à séparer les particules selon leur charge.
La séparation peut être réalisée soit dans une colonne, soit sur une feuille avec une phase mobile liquide et un support solide comme phase stationnaire. Les revêtements intérieurs de la colonne peuvent être très différents selon ce que l’on souhaite analyser compte tenu des interactions composant-échantillon.
La phase mobile se déplace le long de la phase stationnaire, entraînant avec elle les composants de l'échantillon séparés au cours de la chromatographie. En CL, l'interaction entre les molécules de l'échantillon et le milieu chromatographique est influencée par plusieurs facteurs tels que la taille, la charge, la liaison par affinité, l’adsorption ou l'hydrophobie.
La chromatographie liquide est utilisée pour séparer (séparation moléculaire) des composés solubles peu sensibles à la chaleur (protéines, etc...). Ainsi elle trouve ses principales applications dans les laboratoires en pharmacie ou recherche.

Les types de chromatographie liquide

Il existe plusieurs types de chromatographie liquide:

Chromatographie liquide - CL.
Chromatographie liquide avec détecteur de Spectrométrie de Masse - CL/SM
Supercritique : cette méthode utilise les propriétés du CO2 qui, sous certaines conditions de pression et de température (>31°C et >73b), devient un solvant.

Les formes avancées de CL

La chromatographie liquide à haute performance ou chromatographie liquide à haute pression (CLHP ou HPLC) est une forme évoluée de la CL. Elle utilise une pression élevée (20-150b) pour forcer l'échantillon à traverser la colonne et ainsi gagner en vitesse, abaisser le seuil de détection et améliorer la fiabilité et précision. C'est actuellement la méthode d'analyse quantitative la plus utilisée dans les laboratoires d'analyse et l’industrie pharmaceutique.

CL-SM, fiabilité et polyvalence

La chromatographie en phase liquide couplée à des détecteurs de Spectrométrie de Masse est une méthode analytique chimique combinant les deux technologies. Elle apporte de la polyvalence (détecter une gamme plus large de molécules) et de l’efficacité (ex:molécules très complexes) afin d’identifier et/ou de quantifier précisément de nombreuses substances. Cette technologie, au départ chère, tend à devenir plus abordable et se développe.

La chromatographie supercritique sans solvant chimique

Cette technique utilise comme solvant le CO2, un gaz qui devient solvant dans des conditiions de température supérieure à 31°C et à pression de 73 bar. La chromatographie ciquide au CO2 apporte tous les avantages d’un solvant classique tout en étant plus respectueux de l'environnement. L’échantillon est dilué en phase liquide et rapidement disponible en phase gazeuse pour une plus grande efficacité. Contrairement à un solvant classique, l’étape supplémentaire d’élimination du solvant par balayage azote n’est pas nécessaire.

Contactez un expert

Les différences entre les chromatographie en phase gazeuse et liquide

Comme son nom l'indique et contrairement à la chromatographie en phase gazeuse,, la chromatographie liquide utilise comme support une phase mobile liquide. Les liquides sont généralement des mélanges de solvants de polarités compatibles alors qu'en chromatographie gazeuse, la phase mobile est un seul gaz de haute pureté.

Cromatografia supercrítica sem solventes químicos

Bien d’autres caractéristiques dont nous retrouvons les principales dans le tableau ci-après, différencient ces deux méthodes.

Chromatographie liquide	Chromatographie en phase gazeuse
La phase mobile est un liquide	La phase mobile est un gaz
La séparation est basée sur l'interaction du soluté avec le milieu chromatographique.	La séparation est principalement basée sur les points d'ébullition des molécules de soluté.
Utilisée pour séparer tout composé soluble, par exemple les acides aminés, les protéines, les médicaments, les acides nucléiques, les lipides, les antioxydants, les glucides et les polymères naturels et artificiels.	Appliquée à la séparation de composés volatils et de mélanges gazeux.
Généralement effectuée à température ambiante, cette technique permet d'analyser en toute sécurité les composés sensibles à la chaleur.	Réalisée à des températures plus élevées, les substances thermiquement sensibles peuvent être dénaturées.
Il s'agit d'une technique relativement lente.	Réalisée à des températures plus élevées, les substances thermiquement sensibles peuvent être dénaturées.
Il s'agit d'une technique relativement lente.	L'analyse est plus rapide et se mesure généralement en minutes, bien qu'elle puisse ne prendre que quelques secondes.
Utilise des solvants liquides polaires * comme l'eau ou le méthanol *molécules présentant des polarités différentes dans ses composants	Utilise tout solvant qui s'évapore

Chromatographie en phase gazeuse

Les gaz dans ces technologies

Dans le cas de la LC-MS ou CLHP-MS, le détecteur MSL, lorsqu'il est utilisé, nécessite un flux d'azote pour éliminer efficacement le solvant de l’ échantillon avant l’étape d’identification et de quantification dans le cœur du détecteur. Étant donné, qu’un LC-MS consomme en règle générale 10M3/jour, soit l’équivalent d’une bouteille de 50 litres, plusieurs solutions s’offrent au laboratoire selon le nombre de LC-MS et leur taux d’utilisation :

Bouteilles ou cadres avec une centrale d’inversion.
Récipient liquide avec évaporateur.
Générateur d’azote sur site. Cette solution est possible compte tenu de la qualité de l’azote requise par le fabricant de l'analyseur (autour de N30 soit une pureté de 99,9%). L'utilisation d'un générateur d'azote est courante et confortable. Cet équipement nécessite une maintenance et pour cette raison, il est fortement recommandé de prévoir une solution de secours avec des bouteilles et un système de réseau de gaz.

La chromatographie liquide supercritique utilise le CO2 (qualité Alphagaz SFC - 99,998%) fourni sous forme liquide selon plusieurs options selon les volumes nécessaires: